Nosso objetivo é desenvolver um protocolo para transformação genética de Citrus através do bombardeamento de partículas usando cortes finos de epicótilo como explantes alvo. Neste trabalho foram otimizadas condições para a expressão transiente usando citrange carrizo (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) como modelo. Epicótilos de plântulas de citrange carrizo germinadas in vitro foram cortadas transversalmente em seções de 1 mm e cultivadas em meio MS com 5 miM no escuro. Depois de uma semana, explantes foram bombardeados com o plasmídio pE2113-GUS usando um aparelho de alta pressão de hélio (PDS 1000/He Bio-Rad). As melhores condições para a expressão transiente foram: partículas de tungstênio M-25, pressão de hélio de 1550 psi, distância de 9 cm entre os explantes e DNA/particle holder e cultivo dos explantes em meio com alta osmolaridade (0,2 M manitol + 0,2 M sorbitol) 4 h antes e 20 h depois do bombardeamento. Usando estes parâmetros, uma média de 102 pontos azuis por bombardeamento (20 explantes/placa) foi obtida. Este protocolo esta sendo usado atualmente para transformação de citrange Carrizo e adaptado para transformação de laranja doce (Citrus sinensis).

Studies were carried out to optimize the conditions for transient gene expression through particle bombardment on Carrizo citrange (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) thin epicotyl sections. The best conditions for transient GUS expression were: M-25 tungsten particles, 1550 psi helium pressure, 9 cm distance between specimen and DNA/particle holder and culture of explants in a high osmolarity medium (0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol) 4 h prior and 20 h after bombardment. Under these conditions, an average of 102 blue spots per bombardment (20 explants/plate) were achieved. This protocol is currently being used for transformation of Carrizo citrange and sweet orange (Citrus sinensis).

DNA de alta qualidade para estudos moleculares pode ser facilmente extraído de espécimes frescos. Entretanto, amostras frescas são difíceis de ser mantidas vivas por longos períodos tornando a sua preservação um sério problema, principalmente quando são coletadas e transportadas de locais distantes. Com o objetivo de estabelecer um método eficiente de preservação de Atta spp. (formigas cortadeiras) para extração de DNA visando análises de RAPD, seis diferentes métodos de armazenamento foram avaliados: 1) -70°C; 2) etanol 95% a -20°C; 3) etanol 95% a 4°C; 4) etanol 95% à temperatura ambiente; 5) sílica gel à temperatura ambiente; e 6) tampão (0,25 M EDTA, 2,5% SDS, 0,5 M Tris-HCl, pH 9,2) à temperatura ambiente. O DNA foi extraído (Cheung et al., 1993 - modificado) e examinado aos 90, 210 e 360 dias após o armazenamento. Espécimes frescos foram usados como controle. O DNA total foi medido com minifluorímetro. A qualidade do DNA foi determinada escaneando-se as fotos com densitômetro e a integral da varredura foi calculada para DNA > 9,4 kb. Os dados foram analisados usando o delineamento estatístico de blocos inteiramente casualizados com parcelas subdivididas e com quatro repetições. Todos os métodos foram eficientes para preservar Atta spp. até 210 dias. Até 360 dias, o DNA foi degradado somente em etanol 95% à temperatura ambiente, resultando na ausência de bandas no perfil RAPD quando comparado com os demais métodos de presevação. Embora a preservação a baixas temperaturas seja recomendada para longos períodos, o armazenamento em sílica gel e tampão pode ser considerado alternativa satisfatória quando refrigeração e transporte são fatores limitantes.

High quality DNA for molecular studies can be easily extracted from fresh specimens. However, live samples are difficult to keep for long periods thus making their preservation a serious problem, specially when they are collected and transported from remote locations. In order to establish an efficient method to preserve Atta spp. (leaf-cutting ants) for RAPD analysis, six different storage methods were examined: 1) -70°C; 2) 95% ethanol at -20°C; 3) 95% ethanol at 4°C; 4) 95% ethanol at room temperature; 5) silica gel at room temperature; and 6) buffer (0.25 M EDTA, 2.5% SDS, 0.5 M Tris-HCl, pH 9.2) at room temperature. DNA was extracted (Cheung et al., 1993 - modified) and examined after 90, 210 and 360 days of storage. Freshly killed specimens were used as control. DNA yield was measured with a minifluorometer. DNA quality was determined by scanning photographs with a densitometer and the integral of the scan was calculated for DNA of size > 9.4 kb. Data were analyzed using a completely randomized split-plot design with four replicates. All methods were efficient to preserve Atta spp. DNA up to 210 days. At 360 days, DNA was degraded only in 95% ethanol at room temperature, which resulted in RAPD profiles with missing bands. Although preservation at low temperatures is recommended for long periods, methods using silica gel and buffer can be considered satisfactory alternatives when refrigeration and transportation are limiting factors.